PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。

PCR引物的設(shè)計(jì)原則：

   [1] 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。

   [2] 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)：某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。

   [3] 引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。

   [4] G+C含量在40%~60%之間。

   [5] 堿基要隨機(jī)分布：引物中四種堿基的分布好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

   [6] 引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)：否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性

   [7] 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)：兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。

   [8] 引物5′端可以修飾。

   [9] 引物3′端不可修飾。

 [10] 引物3′端要避開密碼子的第3位：如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。