PCR實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作:

在開始PCR實(shí)驗(yàn)之前，必須準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設(shè)計(jì)或用軟件設(shè)計(jì)），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡拿?

1.DNA聚合酶。

有許多商業(yè) DNA 聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想對(duì)沒有任何突變的特定 DNA 片段進(jìn)行 PCR，請(qǐng)選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測(cè)特定序列的存在，就選擇普通的Taq聚合酶。如果要對(duì)T-vector連接的片段進(jìn)行PCR，要注意，因?yàn)榇蠖鄶?shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有A-tailing，所以應(yīng)該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR實(shí)驗(yàn)后添加A-tailing。

2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設(shè)計(jì)對(duì) PCR 擴(kuò)增的成功至關(guān)重要。

當(dāng)您開始設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)仔細(xì)考慮以下幾個(gè)原則：

①引物的長(zhǎng)度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對(duì)于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來(lái)說(shuō)是足夠長(zhǎng)的。

②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是 佳的。

③GC 含量。佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%。

④許多軟件可用于引物設(shè)計(jì)，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通?？梢詽M足我們的需求。