PCR反應(yīng)需要以雙鏈DNA作為模板，因此初的PCR反應(yīng)用于檢測(cè)目標(biāo)樣本的基因組中是否存在特定的目的片段，但是這種以基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)無(wú)法檢測(cè)目的基因是否在樣本中表達(dá)，此外由于真核生物的基因中存在內(nèi)含子，直接通過(guò)基因組DNA進(jìn)行PCR也很難確定樣本中是否存在目的基因，針對(duì)這一問(wèn)題，發(fā)展出了逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術(shù)。

RT-PCR技術(shù)原理：

逆轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR) 是以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，之后再進(jìn)行PCR的過(guò)程。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：

1. RNA模板

通常20μL的逆轉(zhuǎn)錄體系，加入總RNA 1μg，如果總RNA加入過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄不充分。

2. 引物

常用的有隨機(jī)引物和Oligo(dT)引物：

隨機(jī)引物會(huì)將所有RNA分子均進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，此時(shí)得到的cDNA大部分來(lái)源于rRNA，主要在部分mRNA含有逆轉(zhuǎn)錄酶終止序列而難以得到其全序列時(shí)使用；

Oligo(dT)與真核生物mRNA的Poly(A)區(qū)域匹配，可以特異性的對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

3. 逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程涉及以RNA為模板合成DNA和以DNA為模板合成互補(bǔ)鏈的兩個(gè)過(guò)程，目前市場(chǎng)上的逆轉(zhuǎn)錄酶都同時(shí)具有這些功能，因此只需在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可，而不需額外加入DNA聚合酶。

4. 4種dNTPs